PMCID: PMC10341950 PMID: 37446165
DOI: 10.3390/ijms241310986
Samenvatting
Hypertrofische littekens en keloïden zijn twee verschillende manifestaties van overmatige dermale fibrose en worden veroorzaakt door een verandering in het normale wondgenezingsproces. Behandeling met radiofrequentie (RF)-gebaseerde therapieën heeft zich nuttig gebleken bij het verminderen van hypertrofische littekens. In deze studie werd het effect van een van deze radiofrequentietherapieën, Capacitive Resistive Electrical Transfer Therapy (CRET), op biomarkers van huidfibrose onderzocht. Hiervoor werden in culturen van menselijke myofibroblasten behandeld met CRET-therapie of schijnbehandeling proliferatie (XTT Assay), apoptose (TUNEL Assay) en celmigratie (Wound Closure Assay) geanalyseerd. Bovendien werden in deze culturen ook de expressie en/of lokalisatie van extracellulaire matrixeiwitten zoals α-SMA, Col I, Col III (immunofluorescentie), metalloproteïnasen MMP1 en MMP9, MAP-kinase ERK1/2 en de transcriptiefactor NFκB onderzocht (immunoblot). De resultaten hebben aangetoond dat CRET de expressie van extracellulaire matrixeiwitten vermindert, de expressie van de metalloproteïnase MMP9 verandert en de activatie van NFκB ten opzichte van controles vermindert, wat suggereert dat deze therapie nuttig kan zijn voor de behandeling van fibrotische pathologieën.
Trefwoorden: fibrose, hypertrofische litteken, keloïden, radiofrequentie, myofibroblast, metalloproteïnase, extracellulaire matrixeiwitten, MAP-Kinases, NFκB
1. Inleiding
Het wondgenezingsproces bestaat uit een complexe opeenvolging van gebeurtenissen die zijn georganiseerd in drie opeenvolgende fasen: ontstekingsfase, proliferatiefase en remodelfase [1,2,3].
Tijdens de proliferatiefase worden fibroblasten geactiveerd en krijgen ze het vermogen om alfa-gladde spieractine (α-SMA) tot expressie te brengen, waarbij ze differentiëren in myofibroblasten. Deze gedifferentieerde fibroblasten stellen de wond in staat samen te trekken en te sluiten. Zodra de wond gesloten is, gaan de myofibroblasten onder normale fysiologische omstandigheden in apoptose en worden ze vervangen door fibroblasten. Bij wondgenezing grijpen verschillende biochemische/cellulaire signalen, zoals Wnt- en Notch-signalering, AKT/mTOR, transformerende groeifactor-bèta (TGF-β), mitogeen-geactiveerde eiwitkinase (MAPK) of bindend eiwit aan de nucleaire factor kappa-enhancer (NF-ĸB), in in een nauw gecoördineerde cascade om de schade te herstellen [4]. Wanneer dit proces wordt gedereguleerd, kunnen abnormale of overmatige littekenvorming optreden, wat leidt tot de ontwikkeling van cutane fibrose, die zich klinisch manifesteert in hypertrofische en keloïde littekens.
Beide typen fibrose worden onderscheiden door hun etiologie, symptomen, oorzaken en locatie, onder andere [3]. De belangrijkste oorzaken van hypertrofische littekens zijn operaties, ernstige brandwonden, trauma of zelfs insectenbeten, terwijl keloïden meestal enkele maanden of zelfs jaren na een verwonding of ontsteking van de huid ontstaan, en het kan worden veroorzaakt door lichte huidschade zoals piercings, vaccinaties of acne [5]. Hoewel de etiologie van keloïden onbekend is, is er een sterk geassocieerd genetisch, raciale en anatomische component waargenomen, aangezien ze vaker voorkomen bij Afro-Amerikanen en Aziaten, en in het bovenste deel van het borststuk of oorlel [6]. Chronische infecties en herhaalde verwondingen kunnen ook de vorming van hypertrofische littekens en weefselfibrose bevorderen [7].
Op weefselniveau vertonen hypertrofische littekens en keloïden hyperplasie, zwelling en roodheid, waarbij abnormale groei een specifiek kenmerk is van keloïden, die meestal buiten de randen van de oorspronkelijke wond binnendringt, in tegenstelling tot hypertrofische littekens, die beperkt blijven tot de oorspronkelijke randen van de laesie [8]. In beide pathologieën worden de myofibroblasten niet vervangen door fibroblasten, maar blijven ze in de prolifererende laesie met lage apoptosepercentages [6]. Deze myofibroblasten veroorzaken aanhoudende chronische ontsteking, door de continue productie van profibrotische cytokines en chemokines, zoals TGF-β1, TGF-β2, VEGF, FGF en CTGF [9], en synthetiseren een grote hoeveelheid fibrotische extracellulaire matrix, bestaande uit collageentypes I en III, en α-SMA, wat de normale werking van de aangedane weefsels verhindert [10]. Deze disfunctie veroorzaakt bij de meeste patiënten langdurig jeuk en pijn [11]. Bovendien veroorzaken deze pathologieën vanuit psychologisch oogpunt een negatieve cosmetische en emotionele impact op patiënten, wat zelfs hun sociale interactie kan beperken en hun zelfvertrouwen kan beïnvloeden [12].
Momenteel vormen hypertrofische littekens en keloïden een grote uitdaging voor dermatologen en chirurgen vanwege het gebrek aan effectieve specifieke behandelingen. Corticosteroïde toediening, chirurgische excisie, siliconengels, lokale radiotherapie, hormonale therapie of laser zijn de conventionele behandelingen, maar leiden vaak niet tot volledige genezing, vooral bij keloïden vanwege hoge recidiefpercentages [13]. Er is experimenteel bewijs dat hyperthermie veroorzaakt door radiofrequentie (RF) effectief is bij litteken- of keloïdregeneratiebehandelingen. In dit opzicht wijst klinisch bewijs erop dat de toepassing van RF [14,15], alleen of in combinatie met andere fysiotherapieën zoals laser [16] of echografie [17], effectief kan zijn voor de behandeling van hypertrofische en keloïde littekens. Daardoor induceren fysiotherapieën een remodelering van het collageen dat is ontstaan door de denaturatie van de vezels door hyperthermie. In het bijzonder zijn therapieën met capacitieve RF nuttig gebleken voor het verminderen van hypertrofische littekens en het vergroten van de flexibiliteit van fibrotisch huidweefsel [18]. Een van deze capacitieve therapieën is Capacitieve Resistieve Elektrische Transfer Therapie (CRET). Deze niet-invasieve therapie gebruikt frequentiestromen rond 0,5 MHz om diepe verwarming in het behandelde weefsel te induceren. Onder thermische omstandigheden is aangetoond dat het effectief is bij huidregeneratie in diermodellen door verhoogde huidverdikking en een toename van collageenproductie en angiogenese [19]. Daarnaast heeft eerder onderzoek van onze groep aangetoond dat deze therapie, onder niet-thermische omstandigheden, huidregeneratie kan bevorderen via fibroblastmigratie en keratinocyten, fibroblasten en stamcelproliferatie [2,20], evenals differentiatie kan induceren [21]. Deze effecten worden gemedieerd door veranderingen in de expressie en lokalisatie van intercellulaire adhesie-eiwitten of cel-substraat adhesie-eiwitten, en in kinasen die betrokken zijn bij celproliferatie en migratie. Op deze manier zou elektrische stimulatie de vorming van granulatieweefsel vóór het sluiten van de externe weefsellagen bevorderen, waardoor abnormale genezing van de wond of chronisatie wordt voorkomen.
Wat fibrotische processen betreft, is het gepubliceerde experimentele bewijs, afgezien van gevallen van gunstige effecten van CRET die in de kliniek zijn waargenomen, ongeldig en zijn de biologische onderslagen van deze effecten onbekend. Gezien het ontbreken van effectieve strategieën voor de behandeling van deze fibroses, is het van groot belang om nieuwe therapeutische alternatieven voor de bestaande te promoten voor hun behandeling. Op deze basis was het doel van deze studie om in menselijke celmodellen onder normotherme omstandigheden het potentiële vermogen van CRET te onderzoeken om reeds gevormde hypertrofische of keloïde littekens te regenereren en/of hun vorming in de beginfase van genezing vóór consolidatie te voorkomen, bij patiënten met een klinische aanleg om ze te genereren.
2. Resultaten
2.1. Productie van extracellulaire matrixen
De immunoblot toonde een statistisch significante vermindering van 20 ± 6,3% (p = 0,011; T-test van de leerling) over de controle in α-SMA-expressie, in culturen behandeld met CRET gedurende 48 uur (Figuur 1A). Dit eiwit werd ook geanalyseerd met immunofluorescentie, en beeldanalyse bevestigde de afname (38% ten opzichte van controles) in de hoeveelheid α-SMA in met CRET behandelde culturen versus controles (Figuur 1B,C). Bovendien daalde het collageen type I ook met 23% en het collageen type III met 16% vergeleken met de controlegroep. De resultaten waren statistisch significant in alle drie de analyses (Figuur 1B, C).
α-SMA, Col I en Col III expressie. (A) α-SMA, Col I en Col III eiwitexpressie van myofibroblasten na 48 uur CRET of schijnbehandeling. Fluorescentieintensiteitsmeting per MHC-kanaal. Data genormaliseerd over de bijbehorende schijn-blootgestelde controles (gestippelde lijn geeft de controlegroep aan: 100%). Betekent ± SEM van de fluorescentieintensiteit/totale kernen van ten minste drie experimentele herhalingen per eiwit. *: 0,05 > p ≥ 0,01; T-test van de leerling. (B) Inmunoblot voor α-SMA. Representatieve bluts na 48 uur CRET of schijnbehandeling (100 μg eiwit/baan). GAPDH werden gebruikt als laadregeling. C: Controle. T: KRET-behandeling. (C) Immunofluorescentieexpressie van α -SMA, Col I, Col III en samengevoegde micrografieën. Representatieve microfoto's. Rood: α-SMA, Groen: Col I of Col III. Blauw: celkernen. Schaalbalk: 20 μm.
2.2. Celproliferatie en -dood
De myofibroblasten die 48 uur met CRET werden behandeld, verminderden hun proliferatie vergeleken met de controlegroep, zij het zeer zwak (4% boven controle; statistisch significant) (Figuur 2A). Aan de andere kant verminderden elektrisch behandelde myofibroblasten het aantal apoptotische cellen significant, hoewel het aandeel TUNEL+-cellen laag was in de culturen en niet meer dan 10% van het totaal aantal cellen in een van de replicaten uitmaakte (Figuur 2A,B).
XTT en TUNEL assays. (A) Proliferatieve en apoptotische myofibroblastwaardering na 48 uur intermitterende SET-behandeling. Data zijn gemiddelden ± SEM genormaliseerd over de overeenkomstige schijn-blootgestelde controles (de stippellijn vertegenwoordigt de controlegroep: 100%). Vijf experimentele replica's van de XTT-test en drie experimentele replica's van de TUNEL-assay. : 0,01 ≤ p < 0,05; *: 0,001 ≤ p < 0,01. T-test van de leerling. (B) Representatieve microfoto's van TUNEL+-cellen na 48 uur na CRET of schijnstimulatie. Groen: TUNEL+ cellen; Blauw: Kernen gekleurd met DAPI. Schaalbalk: 20 μm.
2.3. Celmigratie
De resultaten van de wondsluitingstest, uitgevoerd na 24 en 48 uur CRET-behandeling, toonden geen statistisch significante veranderingen in de migratiesnelheid van elektrisch behandelde myofibroblasten vergeleken met de controlegroep (Figuur 3A,B).
Wondtest. (A) Computationele kwantificatie van de gap closure, berekend als de gemiddelde afstand (μm) tussen de randen in drie even ver verwijderde punten van de gap, met behulp van Photoshop-software. De gegevens zijn gemiddelden ± SD, genormaliseerd over de overeenkomstige controles (stippellijn vertegenwoordigt de controlegroep: 100%), van vijf experimentele replicaties per tijdsinterval. NS: p ≥ 0,05; T-test van de leerling. (B) Vertegenwoordigende microfoto's van de wond bij t = 0, 24 en 48 uur na CRET of schijnbehandeling (controle). Schaalbalk: 50 μm.
2.4. Expressie van metalloproteïnasen MMP1 en MMP9
Na 24 uur verhoogde de CRET-behandeling de expressie van MMP9 met 63% vergeleken met controles en waren de verschillen statistisch significant. Integendeel, 48-uurs behandelingen veranderden de expressie van dit eiwit niet ten opzichte van de controle. Ook toonde de uitdrukking van MMP1 geen veranderingen ten opzichte van de controle, op geen van de geanalyseerde momenten (Figuur 4A,B).
MMP's uitdrukking. (A) Densitometriewaarden voor MMP9- en MMP1-expressies bij 24 of 48 uur van CRET- of schijnbehandeling. Gegevens genormaliseerd over de bijbehorende schijnbehandelingscontroles (stippellijn vertegenwoordigt de controlegroep 100%). Betekent ± SD van de eiwit/GAPDH-verhoudingen van ten minste vier experimentele herhalingen per eiwit en tijdsinterval. **: 0,001 ≤ p < 0,01. T-test van de leerling. (B) Vertegenwoordigende vlekken na 24 uur of 48 uur CRET of schijnbehandeling (100 μg eiwit/baan). GAPDH werden gebruikt als laadregeling. C: Controle. T: KRET-behandeling.
2.5. Expressie en activatie van MAP-Kinase ERK1/2 en nucleaire factor (NF)-Kappa B p65
De resultaten van de immunoblot toonden statistisch significante afnames in de expressie van ERK, vergeleken met de controle na 12 uur, terwijl er na 24 uur geen veranderingen in de expressie waren. De actieve vorm van het eiwit (p-ERK) veranderde haar expressie niet na 12 of 24 uur vergeleken met de controlegroep. Aan de andere kant veranderde de NFκB-factor zijn expressie niet ten opzichte van controles, hoewel de activatie dat wel deed. Zo nam de expressie van p-NFκB bij zowel 12 als 24 uur significant af ten opzichte van de controles (Figuur 5A,B).
ERK1/2, p-ERK1/2, NFkB en p-NFkB-expressie. (A) Densitometriewaarden voor ERK1/2, p-ERK1/2, NFkB en p-NFkB-expressies na 12 uur of 24 uur van CRET of schijnbehandeling. Gegevens genormaliseerd over de overeenkomstige schijn-blootgestelde controles (stippellijn vertegenwoordigt de controlegroep 100%). Betekent ± SD van de eiwit/GAPDH-verhoudingen van ten minste drie experimentele herhalingen per eiwit en tijdsinterval. **: 0,001 ≤ p < 0,01. *: 0,05 > p ≥ 0,01. T-test van de leerling. (B) Vertegenwoordigende blots na 12 uur of 24 uur van CRET of schijnbehandeling (100 μg eiwit/baan). GAPDH werden gebruikt als laadregeling. C: Controle. T: KRET-behandeling.
3. Discussie
Cutane fibrose is een huidpathologie die pijn, jeuk, gebrek aan functionaliteit en psychologische problemen omvat bij patiënten die eraan lijden. De belangrijkste behandelingen voor hypertrofische littekens of keloïden worden niet als volledig bevredigend beschouwd omdat ze niet erg effectief zijn, pijn kunnen veroorzaken of bijwerkingen hebben. Laser is een van de eerste behandelingen, maar het is duur en vereist herhaalde sessies. Andere alternatieven, zoals intralesionele behandelingen met corticosteroïden, bleomycine of 5-fluorouracil, zijn pijnlijk en vereisen meerdere infiltraties. Lokale radiotherapie is een goed behandelingsalternatief, maar moet worden toegepast in gespecialiseerde centra en in meerdere sessies die de bestraling van de patiënt produceren. In elk geval moet de aanpak multidirectioneel zijn, daarom wordt meestal gekozen voor de combinatie van behandelingen. Om deze reden vormen deze fibroses een uitdaging voor de geneeskunde, en het is van groot belang om alternatieve therapieën voor hun behandeling te vinden.
Momenteel wordt er vooruitgang geboekt in het begrijpen van het moleculaire mechanisme van deze fibrosen, wat nieuwe therapeutische strategieën oplevert voor de behandeling van deze pathologie. Aangezien de pathologische kenmerken van cutane fibrose worden gekenmerkt door een overschot aan extracellulaire matrix geproduceerd door fibroblasten op weefselniveau, streven de werkingsmechanismen van deze nieuwe therapieën ernaar één of meer van de volgende doelen te bereiken: vermindering of remming van de proliferatie van fibroblasten en myofibroblasten, vermindering of remming van de productie van extracellulaire matrix (collageen, α -SMA en fibronectine), verhoogde apoptose of necrose van fibroblasten, verminderde expressie van TGF-β1 (een belangrijke regulator van de collageensynthese), verminderde expressie van de GFR β1/Smad2/3 signaalroute, veranderingen in de activiteit van metalloproteïnasen, verminderde of gemoduleerde ontsteking, en/of verhoogde productie van IFN-α (vanwege de antifibrogene capaciteit of verhoogde normale angiogene activiteit) [22]. In deze studie hebben we onderzocht of CRET-therapie kan inwerken op een of meerdere van deze belangrijke werkingsmechanismen bij huidfibrose.
Vanwege de relevantie van de productie van extracellulaire matrix (ECM) bij de vorming van het fibrotische proces, onderzochten we eerst of CRET de synthese van matrixcomponenten kon verminderen of de bestaande kon afbreken. Sterker nog, talrijke onderzoeken gericht op het vinden van nieuwe farmacologische strategieën richten zich op de reductie van collageen- en extracellulaire matrixafzettingen zoals hypertensiven, waaronder het angiotensine converterende enzym ACE-remmer [23], calcineurineremmers [24], doxorubicine [25], schokgolftherapie [25,26], stamceltherapie, interferonen [5], tamoxifen [27] of RNA-gebaseerde therapieën [28]. Sommige elektrische therapieën hebben ook aangetoond dat ze collageenafzettingen in fibrotische processen kunnen verminderen door afbraak ervan. Elektrische therapieën met degeneratieve golven hebben dus een verbetering van pijn en jeuk laten zien, evenals een vermindering van de vorming van overtollig collageen in keloïden [29]. Bij RF-gebaseerde therapieën induceert de behandeling van hypertrofische littekens met matige thermische stijgingen (onder 40 °C) veroorzaakt door monopolaire radiofrequentie een hervorming van collageenvezels, hetzij als één behandeling [14] of in combinatie met negatieve druk [18]. Andere RF-therapieën hebben ook veranderingen laten zien in de morfologie of productie van collageenvezels [15] of een vermindering van de hoeveelheid collageen I, collageen III en TGF-β1 in littekens, wanneer RF wordt gecombineerd met gepulseerd licht versus laser [16]. In onze studie onder subthermale omstandigheden verminderde de behandeling van myofibroblasten in CRET significant de hoeveelheid collageen type I, type III en α-SMA in hun ECM. Het is bekend dat de veranderingen die door RF-gebaseerde therapieën in het bindweefsel worden veroorzaakt, niet uitsluitend worden verklaard door de temperatuurstijging [30]. Aangezien de CRE-therapie in onze experimenten is toegepast onder normothermieomstandigheden (37 °C), zouden de waargenomen veranderingen in het collageengehalte niet gerelateerd zijn aan denaturatie en herschikking van de vezels, maar aan andere moleculaire mechanismen zoals de modulatie van de activiteit van metalloproteïnasen (MMP's) of de Smad2/3-route.
MMP's lijken inderdaad ook een cruciale rol te spelen bij wondgenezing en littekenvorming, en hun remming kan een strategie zijn om fibrose te behandelen. MMP's zijn endopeptidasen met een katalytisch domein van Zn2+-ionen die interageren met meerdere componenten van de extracellulaire matrix [31]. Er is gerapporteerd dat de expressie van MMP's verhoogd is bij huidlaesies vergeleken met intacte huid, terwijl hypertrofische littekenfibroblasten een lage MMP-1 [32] en MMP9 [33] activiteit lijken te hebben, wat de ophoping van collageen bevordert. Om deze reden hebben sommige nieuwe therapieën geprobeerd de expressie van MMP's te moduleren. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat schokgolven in staat zijn de collageenvezels van keloïden te verminderen door een toename van de expressie van MMP13 [25], terwijl stamceltherapieën de expressie van weefselremmer van metalloproteïnase 1 (TIMP-1) in keloïde fibroblasten verzwakten [34], wat de activiteit van MMP's zou bevorderen. Evenzo konden druktherapieën de expressie van MMP9 en MMP12 in weefsel van hypertrofische littekens verhogen [35]. In deze studie werd geanalyseerd of de waargenomen afname van elektrisch geïnduceerde collageenexpressie en -gehalte te wijten kon zijn aan een modulatie in de expressie van twee van deze MMP's: MMP1 en MMP9. De resultaten toonden aan dat MMP9 significant toeneemt na 24 uur CRET-behandeling, terwijl er geen veranderingen in MMP1-expressie werden vastgesteld vergeleken met de controlegroep. Deze activatie van MMP9 zou dus verantwoordelijk kunnen zijn voor de afbraak van collageen I en collageen III die na elektrische stimulatie worden waargenomen, wat de vermindering van fibrose bij CRET-behandelingen zou bevorderen.
Aan de andere kant overexpresseren fibroblasten afkomstig van hypertrofische littekens transglutaminase, wat hun apoptose zou kunnen remmen, waardoor het fibrotische fenotype wordt versterkt door het aantal cellen dat in staat is extracellulaire matrix te genereren te vergroten [42]. Om deze reden is dit enzym het doelwit geweest van fysiotherapieën zoals degeneratieve elektrische golfvormstimulatie in combinatie met fotodynamische therapie [43]. In onze studie veroorzaakte behandeling met CRET een afname van apoptose in culturen vergeleken met die niet elektrisch behandeld, hoewel het werkelijke aandeel gedetecteerde apoptose zeer laag was. De proliferatieve fase van wondgenezing omvat ook de actieve migratie van fibroblasten [6]. In onze CRE-assays veranderde de migratiesnelheid van myofibroblasten niet ten opzichte van controle. Daarom zou CRET de migratie- en apoptoseprocessen van myofibroblasten niet significant veranderen.
De huid wordt beschouwd als een neuro-endocrien orgaan dat immunologische, endocriene en neurologische functies heeft om de homeostase van het lichaam te behouden. Om deze reden drukken de aanwezige cellen en de circulerende cellen van het immuunsysteem neuropeptiden en neurotransmitters uit, en produceren zij endocriene factoren en cytokines als reactie op stress [44]. Dit organisatiesysteem wordt de cutane hypothalamus-hypofyse-bijnieras (cHPA) genoemd en de functies ervan worden gereguleerd via twee hoofdsignaleringsroutes: het corticotropine-releasing hormone (CRH)-pad en het proopiomelancortin (POMC)-pad.
Huidcellen activeren de CRH-signaalweg onder fysiologische, pathologische omstandigheden, of na stimulatie met microbiële antigenen of UVB-spectrum straling. Via het CRH-pad reguleren deze cellen celproliferatie en differentiatie, evenals de activiteiten van het immuun- of endocriene systeem [45]. CRH kan als een pro-inflammatoire factor fungeren, aangezien is beschreven dat de activatie van deze CRH-route de activiteit van NFkB stimuleert [46], een belangrijke transcriptiefactor die een veelheid aan genen reguleert die verantwoordelijk zijn voor het triggeren van de ontstekingsreactie. Er is aangetoond dat NFkB wordt geactiveerd in keratinocysten en fibroblasten van keloïden [8]. Bovendien veroorzaken myofibroblasten bij fibrose aanhoudende chronische ontsteking, door de continue productie van profibrotische cytokines en chemokines, zoals TGF-β1, TGF-β2, VEGF, FGF en CTGF [9].
NFkB wordt ook gemoduleerd door het proopiomelanocortin POMC-signaalpad. In huidcellen zoals keratinocyten wordt NFkB indirect geremd door α-melanocytenstimulerende hormonen (α-MSH) [45], terwijl bij fibroblasten α-MSH de activatie van NFkB vermindert [47]. Aan de andere kant kan de expressie van POMC-genen, en de productie van POMC-peptiden en -eiwitten, worden versterkt door elektromagnetische straling zoals UVB, onder andere [45]. Recente studies tonen aan dat therapieën gebaseerd op de POMC-route een nieuwe therapeutische strategie kunnen zijn voor de behandeling van ziekten gerelateerd aan fibrotische aandoeningen, aangezien melanocortine-medicijnen aangetoond hebben collageenafzetting, myofibroblastactivatie en de productie van pro-inflammatoire mediatoren te kunnen verminderen [47]. De resultaten van onze studie tonen aan dat CRET de activatie van NFkB in myofibroblasten vermindert en de expressie van collageen via MMP9 vermindert. Gezien deze resultaten, en aangezien POMC en CRH worden geactiveerd door elektromagnetische straling, kan niet worden uitgesloten dat CRET-radiofrequentiestromen ook via deze POMC- of CRH-signaalroutes kunnen werken. Indien dat zo is, zou de fysiotherapie van CRET de pro-inflammatoire respons in myofibroblasten via dit cutane neuro-endocriene mechanisme kunnen verminderen, zonder andere potentiële routes uit te sluiten die nog bestudeerd moeten worden.
4. Materialen en Methoden
4.1. Celcultuur
Menselijke dermale fibroblasten (HF), geïsoleerd uit neonatale voorhuid (cat. nr. C-004-5C, Thermo Fisher, Carlsbad, CA, VS), werden gezaaid in een medium bestaande uit hoogglucose D-MEM (Biowhittaker, Lonza, Verviers, België) aangevuld met 10% geïnactiveerd fotaal rundereserum (Gibco, Waltham, MA, VS), 1% glutamine en 1% penicilline-streptomycine (Gibco) en gehouden in een 5%CO2-atmosfeer bij een temperatuur van 37 °C binnenCO2 broedmachines (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). De cellen werden eenmaal per week subgekweekt.
HF werden geplateerd met een dichtheid van 450 cellen/cm² op de bodem van 60 mm petrischalen (Nunc, Roskilde, Denemarken), behalve bij immunofluorescentietests, waarbij de cellen werden gezaaid op glazen dekmantels die aan de onderkant van de platen waren geplaatst. Een dag na het zaaien werden cellen geïncubeerd met een volledige DMEM, aangevuld met 2 ng/mL TGF-β1 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, VS), voor nog eens 12 of 13 dagen, afhankelijk van het experiment, waarbij dit geconditioneerde kweekmedium elke 4 dagen werd vernieuwd (Figuur S1). Afhankelijk van het doel van het bijbehorende experiment werden in totaal 5 of 10 Petrischalen gebruikt voor experimentele replicatie.
4.2. Elektrische behandeling
De procedure voor RF-blootstelling is elders uitvoerig beschreven [48,49]. Kort na het zaaien werden paren steriele roestvrijstalen elektroden, speciaal ontworpen voor in vitro stimulatie, in alle petrischalen geplaatst en in serie verbonden. Alleen de elektroden van schotels voor elektrische stimulatie werden geactiveerd met een signaalgenerator (Indiba Activ HCR 902, INDIBA,® Barcelona, Spanje), terwijl de overige platen gelijktijdig werden belicht in een identieke, aparte CO2-incubator. Het intermitterende stimulatiepatroon bestond uit pulsen van 5 minuten van 448 kHz, een sinusgolfstroom geleverd bij subthermale dichtheden van 100 μA/mm2, gescheiden door interpulsen van 4 uur, en toegediend voor een totaal van 12, 24 of 48 uur. Dergelijke blootstellingsparameters zijn aangetoond de proliferatie en vroege differentiatie van humane, vet-afgeleide stamcellen te stimuleren [20,21,50] en in menselijke dermale fibroblasten en keratinocyten [2].
4.3. XTT Proliferatie-assay
Celproliferatie werd vastgesteld met een XTT-test (Roche, Zwitserland). Na 48 uur CRET- of schijnbehandeling werden de cellen 3 uur geïncubeerd met het tetrazoliumzout XTT in een atmosfeer van 37 °C en 6,5%CO2, zoals aanbevolen door de fabrikant. De celcultuurconfluentie bereikte 60–70%. De metabolisch actieve cellen reduceerden XTT tot gekleurde formazanverbindingen die werden gekwantificeerd met een microplaatlezer (TECAN, Männedorf, Zwitserland) bij een golflengte van 492 nm. Er werden minstens 3 experimentele replicaten per celtype uitgevoerd.
4.4. TUNEL Assay
Apoptose in culturen werd beoordeeld met de TUNEL-assay. Hiervoor werd het DeadEndTM Fluorometric TUNEL System (Promega, Madison, WI, VS) gebruikt. Cellen die 48 uur werden behandeld met CRET- of schijnblootstelling, werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde (Merck, Darmstadt, Duitsland) en vervolgens uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De fluorescentie van apoptotische cellen werd vastgesteld met fluorescentiemicroscopie. Kernen werden tegengekleurd met ProLongTM Gold antifade reagens met DAPI (Invitrogen, Eugene, OR, VS). TUNEL+-cellen werden beoordeeld met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Nikon Eclipse Ts2R, Nikon, Tokio, Japan) gekoppeld aan een digitale camera (Nikon DS-Ri2). Fotomicrografieën werden gemaakt en de beelden werden computergeanalyseerd met NIS-Elements Br beeldsoftware (versie 4.40, Nikon, Japan). TUNEL+ celidentificatie en kwantificatie waren gebaseerd op vaste fluorescentiedrempels (MHC-modus) die aan het begin van de analyse voor alle beelden werden bepaald en geautomatiseerd. De verkregen waarden werden genormaliseerd ten opzichte van het aantal cellen per veld. Er werden drie experimentele replicaties uitgevoerd.
4.5. Wondtest
In elke experimentele replica van de wondsluitingstest werden HF op 8 platen gezaaid en geïncubeerd bij 37 °C. Na 10 dagen incubatie met TGF-β1 werd er een wond gekrabd op de samenvloeiende monolaag van elke platen, met behulp van een glazen pipetpunt. De afwas werd afgewassen met PBS (Gibco) om vuil te verwijderen, en de culturen werden gehouden in een D-MEM-medium met een hoog glucosegehalte en aangevuld met 10% geïnactiveerd fotaal rundserum (Gibco), 1% glutamine, 1% penicilline-streptomycine (Gibco) en 2 ng/mL TGF-β1. Vervolgens werden 4 platen blootgesteld aan CRET gedurende 24 of 48 uur, terwijl de overige platen voor dezelfde intervallen schijnbelichting waren. Op 0, 24 en 48 uur na het krabben werden 6 microfoto's gemaakt van 3 even ver verwijderde punten in de wonden, met een digitale camera (Nikon DS-Ri2) gekoppeld aan een omgekeerde microscoop (Nikon Eclipse Ts2R). De sluitingssnelheid van de wond werd bepaald met dubbele analyses van de verkregen beelden, met behulp van standaard Photoshop-software (Adobe Photoshop CS3, Extended versie 10.0). Vijf experimentele replicaties werden uitgevoerd.
4.6. Immunofluorescentie voor α-SMA, Collageen Type I en Collageen Type III
Aan het einde van 48 uur RF- of schijnblootstelling werden de monsters gefixeerd met 4% paraformaldehyde (Merck, Darmstadt, Duitsland) en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met muis monoklonale anti-α-gladde mus actine-antistof α-SMA (1:400; cat. nr. A 2547; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, VS), konijn polyklonaal anti-collageen type I antilichaam (1:400; kat. nr. NB600-408-0,1 mg; Novus; Centennial, CO, VS) en konijn polyklonaal anti-collageen type III alfa 1 antilichaam (1:400, kat. nr. NB600-594SS; Novus; CO, VS). Daarna werden de monsters fluorescentie-gekleurd met Alexa FluorTM 568 geitenanti-muis IgG (1:500; cat. nr. A11031; Invitrogen; Eugene, OR, VS) of Alexa FluorTM 488 geitenanti-konijn IgG (1:500; cat. nr. A11031; Invitrogen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, en de celkernen werden tegengekleurd met ProLongTM Gold antifade reagens met DAPI (Invitrogen). Fotomicrografieën werden gemaakt met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Nikon Eclipse Ts2R) gekoppeld aan een digitale camera (Nikon DS-Ri2) en de beelden werden computergeanalyseerd met NIS-Elements Br beeldsoftware (Nikon). Fluorescentieintensiteitsmeting per MHC-kanaal werd gebruikt om de fluorescentie te beoordelen van monsters die met Alexa Green of Alexa Red waren gelabeld. Voorafgaand aan de analyse werden MHC-modusfluorescentiedrempels ingesteld en toegepast op alle beelden. De verkregen waarden werden genormaliseerd ten opzichte van het aantal cellen per veld. Er werden minstens drie replicaties van elk eiwit uitgevoerd.
4.7. Immunoblot voor α-SMA, MMP1, MMP9, ERK, P-ERK, NF-κB en p-NF-κB
De culturen werden 12 of 24 uur met RF- of sham-blootstelling belicht. Aan het einde van de elektrische behandeling werden de cellen gelyseerd voor eiwitextractie. De immunoblotprocedure is elders uitvoerig beschreven [21,48]. Kort gezegd werden de eiwitmonsters (100 μg eiwitaliquoten) gescheiden in 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel en elektroforetisch overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (Amersham, Buckinghamshire, VK). Blots werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C in muis monoklonale anti-α-gladde spier actine-antistof α-SMA (1:400; kat. nr. A 2547; Sigma Aldrich), konijn monoklonaal anti-MMP-9 antilichaam (1:1000, cat. nr. ab76003; Abcam, Cambridge, VK), konijn monoklonaal anti-MMP1 antilichaam (1:1000; cat. nr. ab134184; Abcam), konijn monoklonaal anti-p44/42 MAPK (ERK1/2) (1:1000; cat.no. 4695; Celsignalering, Danvers, MA, VS), konijn polyklonaal anti-Phospho-ERK1/ERK2), muis monoklonaal anti-NF-ΚB p65 (f-6) (1:1000; cat.no.sc-800; Santa Cruz, CA, VS), en konijn monoklonaal anti-fosfo-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) (1:1000; cat.no. 3033; Celsignalering). Konijn polyklonaal anti-GAPDH antilichaam (1:500, kat. Nee. SC-25778; Santa Cruz Biotechnology) werd gebruikt als laadregeling. De membranen werden een uur lang bij kamertemperatuur geïncubeerd met anti-muis IgG mierikswortelperoxidase geconjugeerd antilichaam (1:10.000 NA931; GE Heathcare, Hatfield, VK) en met anti-konijn IgG mierikswortelperoxidase-geconjugeerd antilichaam (1:5000 NA934; GE Healthcare). Vervolgens werden de membranen gescand met een Bio-Rad beeldvormingssysteem (Hercules, CA, VS). De verkregen banden werden densitometrie geëvalueerd (PDI Quantity One 4.5.2 software, BioRad). Er werden minstens drie experimentele replicaten per eiwit uitgevoerd. Alle waarden werden genormaliseerd over de belastingregeling.
4.8. Statistische Analyse
Alle procedures en analyses werden uitgevoerd onder blinde omstandigheden voor de behandeling. Er werden minstens drie onafhankelijke replicaties uitgevoerd per experiment of blootstellingsinterval. De resultaten werden uitgedrukt als gemiddelden ± standaardafwijking (SD) of standaardfout van het gemiddelde (SEM). De t-test van Unpaired Student werd toegepast met GraphPad Prism 6.01-software (GraphPad Software, San Diego, CA, VS). Verschillen p < 0,05 werden statistisch als significant beschouwd.
5. Conclusies
Deze studie toont aan dat CRET-therapie kan werken op cutane fibrose, waarbij de fibrotische extracellulaire matrix wordt verminderd, wordt ingegrepen in de controle van de expressie van de eiwitten die bij de afbraak betrokken zijn, en de activatie van pro-inflammatoire transcriptiefactoren zoals NFkB wordt verminderd. Deze studie biedt dus enkele biologische basis voor de effecten van CRET. Hoewel de resultaten suggereren dat deze therapie nuttig is voor de behandeling van cutane fibrose, is een dieper begrip van de cellulaire en moleculaire responsmechanismen op CRET noodzakelijk. Aan de andere kant werd deze studie in vitro uitgevoerd, wat een beperking is voor directe extrapolatie naar patiënten. Het is daarom essentieel om studies op organismenniveau uit te voeren en bij voorkeur bij mensen via klinische studies, om het werkelijke nut van CRET-therapie in deze pathologie vast te stellen.